样本相关

采集建议

• 同一项目统一样本类型与抗凝剂，血清与血浆不可混用
• 代谢物易受饮食影响，临床样本建议统一空腹时间并记录
• 避免使用含表面活性剂或高浓度盐的缓冲液，会干扰色谱
• 分装为单次用量，一次性使用，杜绝二次冻融

注意：靶向定量项目按目标物质清单核算样本量，部分低丰度物质需要更大体积，请在方案阶段确认。

采血与处理步骤（血清 / 血浆）

1. 空腹 8–12 h 采血；抗凝管按项目统一（EDTA 或肝素），血清用促凝管
2. 采血后室温静置 30 min（血清）或立即轻柔混匀 5–8 次（血浆）
3. 4 ℃、3000 g 离心 10 min，取上清；避免吸到白膜层与溶血样本
4. 按 100–200 μL/管分装，标好编号与时间，2 h 内转入 −80 ℃
5. 运输：干冰，保持 −70 ℃ 以下；到样前干冰不得耗尽

组织与细胞处理步骤

1. 组织离体后 5 min 内用预冷 PBS 冲洗去血污，剔除脂肪与结缔组织
2. 切成 ≤ 50 mg 小块，液氮速冻 30 s 以上，转入 −80 ℃
3. 细胞用预冷 PBS 洗 2 次去培养基（残留血清会干扰色谱）
4. 弃上清后直接液氮速冻细胞沉淀，不要加 PBS 冻存

常见错误

• × 血清与血浆混用、抗凝剂不统一 → 组间不可比
• × 样本只冻一次后反复解冻取样 → 代谢物降解、重复性差
• × 用含高浓度盐或表面活性剂的缓冲液 → 抑制离子化、污染色谱柱
• × 溶血样本仍用于靶向定量 → 胞内物质外泄导致假性升高

采集建议

• 时间点必须成组设计（如 0 / 15 min / 1 h / 4 h），并在方案中固定采样顺序
• 淬灭速度决定能否捕捉到真实通量，取样后应立即低温处理
• 同批实验需同步留取未标记对照，用于天然丰度校正
• 记录示踪剂批号、浓度与加入时刻，便于复现

注意：示踪剂、标记时长与淬灭方式需在预实验中确认，直接决定可解析的通路范围。

标记实验步骤

1. 预实验确定示踪剂浓度、标记时长与淬灭方式（不同通路差异很大）
2. 细胞达到目标汇合度后换用含示踪剂的新鲜培养基，记录加入时刻 T0
3. 按设计的时间点依次取样，每个时间点独立淬灭（勿先收集再统一处理）
4. 淬灭后离心收集细胞沉淀，与培养基上清分别冻存并标号
5. 始终保留一组未标记对照，用于天然丰度（natural abundance）校正

关键参数建议

• 时间点：至少 3–4 个（如 0 / 15 min / 1 h / 4 h），覆盖上升段而非仅稳态
• 重复：每个时间点 ≥ 3 个生物学重复，且各时间点单独培养起始
• 淬灭：液氮速冻或 −20 ℃ 冷甲醇（≥ 4 倍体积），全程冰上操作
• 记录：示踪剂批号、加入体积、培养温度与取样精确时刻

常见错误

• × 所有时间点从同一批细胞连续取样 → 细胞状态已被改变
• × 标记时间过长达 24 h → 接近稳态，通量信息丢失
• × 淬灭不彻底 → 酶促反应继续，MID 分布偏移

采集建议

• 全程使用低吸附耗材，避免角蛋白污染（戴口罩手套）
• 裂解后尽快变性处理，减少蛋白酶降解
• 修饰组学（磷酸化等）建议同步留取对照样本，且避免使用磷酸盐缓冲液
• PRM 验证项目需提供目标蛋白列表，便于方法开发

注意：蛋白样本对冻融极其敏感，建议一次分装后仅解冻一次。

样本处理步骤

1. 细胞：PBS 洗 2 次，直接加裂解液（含蛋白酶抑制剂）或液氮速冻沉淀
2. 组织：去血污与结缔组织后称重，按 1:5–1:10 (w/v) 加裂解液，冰上匀浆
3. 血清/血浆：避免溶血，按项目要求决定是否去除高丰度蛋白
4. 裂解液 4 ℃、12000–15000 g 离心 10–15 min，取上清测浓度
5. 按 100–200 μg/管分装，−80 ℃ 保存；运输干冰

修饰类项目特别注意

• 磷酸化：全程避免磷酸盐缓冲液；建议同步留取对照，便于区分本底
• 乙酰化/泛素化：加去乙酰化酶/去泛素化酶抑制剂，裂解后尽快变性
• FFPE：标注蜡块年份、固定时间与染色史，切片厚度 5 μm、≥ 4 张
• PRM：提供目标蛋白与肽段列表，便于方法开发与保留时间确认

常见错误

• × 未戴口罩手套 → 角蛋白污染掩盖低丰度蛋白
• × 裂解后室温放置过久 → 蛋白降解、修饰丢失
• × 样本量按"湿重"估算但含大量水分/脂肪 → 实际蛋白量不足

采集建议

• RNA 样本完整性优先于浓度，降解样本不建议上机
• 微生物样本需记录采样部位、时间与环境信息，便于后续分组
• 同一批测序建议统一建库方式，降低批次效应
• 干冰运输时保证到样前干冰未耗尽

注意：扩增子与宏基因组对采样污染非常敏感，请使用无菌耗材并留取空白对照。

RNA 样本处理步骤

1. 组织离体后立即切成 ≤ 5 mm 薄片，液氮速冻或浸入 RNA later（4 ℃ 过夜后 −20 ℃）
2. 提取后测浓度与 RIN 值，RIN ≥ 7 方可用于建库
3. RNA 样本 −80 ℃ 保存，避免反复冻融；运输干冰
4. 同时保留一份备份，防止运输损耗

微生物与 DNA 样本步骤

1. 粪便/土壤：无菌管采集 200 mg 以上，标号后 2 h 内 −80 ℃
2. 采样时同步留取空白对照（同批次耗材开管操作），用于污染评估
3. 全血：EDTA 抗凝，禁用肝素（抑制后续酶反应）
4. DNA 样本要求 A260/280 在 1.8–2.0，避免反复冻融与强光照射

常见错误

• × RNA 降解仍送样 → 建库失败或 3′ 偏好
• × 粪便样本常温放置过久 → 菌群结构漂移
• × 同一比较组分批建库 → 批次效应掩盖生物学差异

采集建议

• 悬液质量决定数据质量：要求无明显团块、无大量碎片
• 解离时间尽量短，避免应激基因表达升高
• 避免使用含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的缓冲液长时间保存细胞
• 若需保存，可按项目确认使用冻存方案并做复苏活率评估

注意：单细胞项目建议先做小样预实验评估活率与细胞类型比例，再确定正式上样量。

悬液制备与送样步骤

1. 组织解离：低温、短时、温和酶解，目标活率 ≥ 80%、无团块
2. 用 40 μm 滤网过滤，离心后用含 BSA 的缓冲液重悬
3. 调整浓度至 700–1200 个/μL，计数并记录活率
4. 现制现送，2–8 ℃ 运输，4 h 内上机；避免剧烈震荡

关键参数建议

• 目标细胞数：按项目目标捕获数反推，一般上样高于目标 1.5–2 倍
• 解离时间尽量 ≤ 30 min，过长会诱导应激基因（Fos/Jun 等）高表达
• 避免含 Ca²⁺/Mg²⁺ 缓冲液长时间保存；不使用固定剂处理活细胞标记样本

常见错误

• × 悬液含大量碎片/死细胞 → 空液滴比例升高
• × 样本放置数小时才上机 → 活率骤降、转录本降解
• × 组织块过大未充分解离 → 细胞类型比例失真

采集建议

• 固定不足或过度固定都会影响抗原暴露，按推荐时间执行
• 免疫组化如需代购抗体，请提前确认种属与克隆号
• 流式样本避免使用固定剂后再染活细胞标记
• 制片方向要求（横切/纵切）请在送样单注明

注意：病理类样本的取材部位直接决定结果解释，建议同时提供 H&E 参考片或影像定位。

分项处理步骤

1. ELISA：血清/血浆 ≥ 50 μL，避免溶血，分装单次用量
2. WB：冰上裂解（含蛋白酶抑制剂），BCA 定量后按 ≥ 20 μg/管分装并变性
3. 流式：EDTA 抗凝全血或悬液 ≥ 100 μL，24 h 内检测，标注目标标记与同型对照
4. 切片：4% 多聚甲醛固定 24–48 h（≤ 1.5 cm 厚），梯度脱水后石蜡包埋
5. 冰冻切片：OCT 包埋，目标切面朝下，干冰运输，避免反复冻融

关键参数建议

• 固定：时间不足抗原暴露不全，过度固定（> 72 h）导致表位封闭
• 切片厚度：石蜡 4–5 μm、冰冻 8–10 μm，按实验目的确认
• 免疫组化：如需代购抗体，请提供种属、克隆号与预期定位
• 切片方向（横切/纵切）与取材部位请在送样单注明，必要时附 H&E 参考片

常见错误

• × 组织块过大导致固定液渗透不足（中心自溶）
• × 流式样本固定后再染活细胞标记 → 结果假阴性
• × 冰冻样本未 OCT 包埋直接冻存 → 切片碎裂