技术资源 · Metabolic Flux & Isotope Tracing Guide
代谢流同位素示踪指南
代谢流分析（metabolic flux analysis）回答的是一般代谢组学回答不了的问题：某个代谢物浓度没变，但通过它的通量可能已经翻倍。本文说明什么时候必须做同位素示踪、实验怎么设计、以及如何判断一家服务商的数据能不能算通量。
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本文要点
- 浓度 ≠ 通量：静态代谢组只能看到池大小，示踪才能看到周转速率
- 标记底物决定结论：13C-葡萄糖看糖酵解/TCA，13C-谷氨酰胺看回补，15N 看氨基酸周转
- 必须做时间序列采样：单点取样无法拟合通量
- 需要同位素校正：13C 天然丰度、标记纯度、代谢物碎片校正缺一不可
01一、什么情况下必须做代谢流
- 药物处理后代谢物浓度不变，但细胞表型（增殖、分化、分泌）明显改变
- 想区分"合成增加"与"降解减少"——静态数据无法区分
- 验证某个酶/转运体的功能改变是否真正影响通路通量
- 肿瘤代谢重编程、免疫细胞活化、发酵工艺优化等通量驱动的场景
如果研究问题只是"两组之间哪些代谢物不同"，用非靶向代谢组学即可，不必上示踪。示踪的成本与实验复杂度都更高。
02二、实验设计要点
| 要素 | 建议 | 常见错误 |
|---|---|---|
| 标记底物 | 13C6-葡萄糖（糖酵解/TCA）、13C5-谷氨酰胺（回补）、13C3-乳酸、15N-氨基酸 | 用未标记同位素或标记纯度不明 |
| 标记时间 | 至少 4–6 个时间点（如 0/15/30/60/120/240 min） | 只取一个终点 |
| 培养基设计 | 标记底物替代对应未标记成分，其余组分一致 | 标记底物浓度与常规培养不同，导致通量失真 |
| 淬灭与提取 | 快速淬灭（冷甲醇/液氮），保持代谢物不周转 | 室温离心过久，代谢物已翻转 |
| 样本量 | 每组 ≥ 4–6 个重复，含 0 时间点 | 没有 0 点，无法扣天然丰度 |
03三、数据怎么算通量
得到同位素分布（M+0、M+1…M+n）后，通常有两类做法：
- 同位素稳态（isotopically steady state）：标记到平台期后，用 M+ 分布反推通量比例，模型简单、结论稳健，适合大多数生物学问题。
- 同位素非稳态（INST-MFA）：拟合时间序列曲线，得到绝对通量（单位 nmol/10⁶ cells/h），需要更多时间点与更严格的模型假设。
报告里至少要给出：同位素分布原始数据、校正方法、通量估算模型与置信区间。只给"M+3 比例升高"这类描述，不算通量分析。
04四、问服务商这五个问题
- 你们是测同位素分布，还是能算出通量？两者工作量差一个数量级。
- 天然丰度与标记纯度校正怎么做？有没有质谱碎片（MS2）校正？
- 时间点设计由谁负责？如果我只能提供终点样本，能否出通量结论？
- 用的什么模型/软件（如 influx_s、13CFLUX2、INST-MFA 自研流程）？
- 能不能同时测细胞内与分泌到培养基中的标记代谢物？
05五、Gereallife 的代谢流服务
Gereallife（上海天济睿生物科技有限公司）提供 13C/15N 同位素示踪与代谢流分析：从标记实验设计、时间序列取样、LC-MS 同位素分布检测，到天然丰度校正与通量估算。可与非靶向/靶向代谢组学联合设计，使静态差异与通量结论互相印证。
Q&A常见问题
代谢流一定要用 13C 吗？
大多数情况是。15N 用于氨基酸/核苷酸周转，2H 可用于特定通路（如糖异生），但通量建模最成熟的仍是 13C。
只有终点样本能做通量吗？
不能做完整的 INST-MFA。若标记已达稳态，可做同位素稳态下的通量比例分析，但结论粒度有限，需要事先确认。
代谢流和代谢组学能一起做吗？
建议一起做：同一批样本先做静态代谢组找差异，再做示踪判断差异来自通量还是池大小变化。
